15, 17, 23, 40, 41, 49, а также в экзонах 26, 35, 39 иденти- фицированы многочисленные полиморфные сайты рестрикции с достаточно высоким уровнем полиморфизма. Особенно перспек- тивным для диагностики является полиморфизм интрона

40, представляющий собой две области варьирующих по числу тетрамерных повторов ТСТА на расстоянии 212 п.о. Амплифика- ция этой части интрона 4О с помощью ПЦР, рестрикция AluI с последующим электрофоретическим разделением позволяет иден- тифицировать до 98 аллельных вариантов этого полиморфизма

(Mercter et al.,1991). Столь выраженный полиморфизм позволя- ет с высокой эффективностью маркировать мутантную хромосому

(ген) и проследить её передачу в потомстве.

Сведения о генокоррекции болезни Виллебранда в доступ- ной литературе не обнаружены.

10.4.6 Фенилкетонурия.

Фенилкетонурия (ФКУ) - одно из наиболее частых аутосом- но-рецессивных заболеваний, обусловленных наследственным де- фектом фенилаланингидроксилазы, приводящим при отсутствии своевременной терапии к тяжелой умственной отсталости. В Ев- ропе один больной ребенок встречается в среднем среди 10 -

17 000 новорожденных. В Ирландии и Шотландии частота ФКУ достигает 1 на 4500 новоржденных (DiLella et al., 1986).

Распространена ФКУ также в Польше и в Белоруссии. В России частота заболевания колеблется в пределах 1 : 8 - 10 000.

Очень важна ранняя диагностика ФКУ, так как при своевремен- ном назначении пациенту диеты, не содержащей фенилаланин, умственная ограниченность, как правило, не развивается или имеет очень стертые формы. Разработаны биохимические скрини- рующие тесты диагностики ФКУ у новорожденных.

Гидроксилирование фенилаланина является достаточно сложным процессом, в котором участвуют, по крайней мере, 3 фермента. Фенилаланингидроксилаза (РАН), гомополимерный фер- мент, состоящий из субъединиц с молекулярным весом 52 кД, продуцируется клетками печени и регулирует превращение L-фе- нилаланина в L-тирозин. Его дефицит приводит к накоплению фенилаланина в сыворотке крови. Гиперфенилаланинемия может возникать также при дефиците дигидроптеридинредуктазы и при дефектах синтеза биоптерина. Однако, эти заболевания, хотя и сопровождаются снижением активности РАН, значительно отлича- ются от классической ФКУ и не коррегируются диетой, лишенной фенилаланина.

PAH-ген транскрибируется в гепатоцитах с образованием мРНК размером 2.4 кб. Наиболее распространенный тип мутаций

- однонуклеотдные замены (миссенс, нонсенс, мутации в сайтах сплайсинга), причем часто эти мутации являются результатом транзиций в 22-х обнаруженных в PAH-гене CpG динуклеотидах.

Крупных структурных перестроек не найдено, хотя имеется не- большой процент точечных делеций. Отмечается неравномерный характер внутригенной локализации мутаций (Scriver et al.,1989). Так, наибольшее число миссенс мутаций встречается в центральной части гена: в экзоне 7, кодирующем участок связывания белка с кофактором, где располжено 5 CpG дупле- тов, а также в экзонах 9 и 12. Преимущественный район лока- лизации делеций - экзоны 1, 2 и 3.

Втури РАН-гена локализованоно более 10 полиморфных сай- тов рестрикции, причем распределения гаплотипов по этим мар- керам среди представителей разных рас и этнических групп значительно различаются. Обнаружено сильное неравновесие по сцеплению между определенными мутациями в PAH-гене и гапло- типами по внутригенным сайтам рестрикции. Так, каждая из 5-и наиболее частых в европейских популяциях мутаций ассоцииро- вана только с одним из более, чем 70 гаплотипов по 8 рест- рикционным полиморфизмам (Eisensmith et al., 1992). Мажорная в западно-европейских популяциях сплайсинговая мутация в до- норном сайте 12-го интрона сцеплена с гаплотипом 3 (DiLella et al.,1986). В то же время другая мутация в экзоне 12 -

R408W, наиболее распространенная на востоке Европы, в част- ности в Белоруссии и России, и не найденная в Японии и Ки- тае, связана с гаплотипом 2 (DiLella et al.,1987). Мажорная в

Европе мутация R158Q в 40% сцеплена с гаплотипом 4, наиболее частым среди жителей Японии и Китая. Распространенная в Тур- ции сплайсинговая мутация в интроне 10, приводящая к

9-и-нуклеотидной инсерции, ассоциирована с "южными" гаплоти- пами 6, 10 и 36.

Сопоставление частот различных гаплотипов по полиморф- ным сайтам рестрикции и мутаций в PAH-гене в разных популя- циях, национальностях и этнических группах позволяет сделать вывод , что большинство из них, или даже все, произошли уже после дивергенции рас. Распространение мажорных мутаций гена

РАН в различных популяциях и этнических группах связано с эффектом основателя. По некоторым оценкам эти мутации воз- никли однократно от нескольких сотен до нескольких тысяч лет тому назад. Однако, в ряде случаев распределение мутаций не может быть обьяснено в генетических терминах, сопоставимых с демографической историей. Несомненно доказанными являются примеры независимого и рекуррентного возникновения в разных популяциях таких мутаций, как R261Q или R158Q. Высокие попу- ляционные частоты специфических мутаций в PAH-гене связаны, по-видимому, не только с эффектом основателя и/или с сущест- вованием эндогенных механизмов повышенного мутагенеза, но и с преимуществом гетерозигот. Высказано предположение, что носительство РАН - мутаций повышает устойчивость организма к токсическому эффекту охратоксина А, продуцируемого некоторы- ми видами грибковой плесени (Aspergillus, Penicillium), раз- вивающимися при хранении зерна и других продуктов

(Woolf,1986). Предполагается, что беременные женщины, гете- розиготные пл РАН -мутациям имеют меньшую вероятность абор- та, индуцированного действием этих микотоксинов. Возможно, высокая частота ФКУ в Ирландии и Шотландии частично может быть обьяснена мягким и влажным климатом этих стран, способствующем росту таких грибов.

В медицинской практике используется как прямая, так и косвенная диагностика мутаций в PAH-гене. Разработан очень быстрый и эффективный метод ПЦР/StyI-диагностики cамой частой в России (более 70%) мутации R408W (Ivaschenko,

Baranov, 1993; Иващенко и др., 1993). Дигностика других ма- жорных мутаций в PAH-гене осуществляется методами ПЦР+АСО, аллель-специфической амплификации (ARMS), методом одноните- вого конформационного полиморфизма (SSCP) (см. Главу IY).

При первичном обследовании семьи черезвычайно удобно исполь- зовать три полиморфные нейтральные мутации в кодонах 232,

245 и 385, сцепленные в Кавказских популяциях с определенны- ми ПДРФ-гаплотипами, а значит и со специфическими мутантными аллелями. Каждая из этих мутаций создает новый сайт рестрик- ции и поэтому их аллельное состояние может быть легко проти- пировано с помощью амплификации и рестрикции (Kalaydjieva et al., 1991). При анализе семьи, в которой отсутствуют легко идентифицируемые прямыми методами мутации, молекулярная ди- агностика может быть проведена с помощью внутригенных поли- морфных сайтов рестрикции. Удобен, в частности, Msp1-поли- морфизм в 8-м экзоне, анализ которого может быть осуществлен методом ПЦР/рестрикции (Wedmeyer et al., 1993). В последнее время появились даные о наличии высокополиморфных сайтов внутри интронов гена РАН, которые оказались особенно удобны- ми для молекулярного маркирования мутантных аллелей (Goltzov et al.1994).

Генокоррекция ФКУ успешно осуществлена в опытах in vitro и в настоящее время находится на стадии эксперимен- тальной разработки (Табл.9.2. Глава IX).

10.4.7 Синдром Леш-Нихана.

Синдром Леш-Нихана - рецессивное сцепленное с полом за- болевание, обусловленное наследственной недостаточностью ги- поксантин-гуанин фосфорибозилтрансферазы (HPRT) и сопровож- дающееся тяжелыми поражениями центральной нервной системы.

Фермент HPRT участвует в регуляции метаболизма пуринов, контролируя превращение гуанина и инозина в соответствующие рибонуклеотиды. Ген HPRT экспрессируется во всех типах кле- ток с образованием мРНК размером 654 п.о.. Культивируемые линии клеток, дефектные по HPRT, устойчивы к 8-азагуанину и

6-тиогуанину, и таким образом, могут быть отобраны на соот- ветствующих селективных средах. Гетерозиготные носители му- таций по HPRT-гену могут быть легко выявлены по наличию 2-х типов клеток - устойчивых и чувствительных к 8-азагуанину, в первичной культуре фибробластов или в клетках волосяных лу- ковиц. В большинстве мутантных клеточных линий количество мРНК нормально, а белок отсутствует. У части пациентов хотя и транскрибируется достаточно много мРНК, но в этих молеку- лах обнаруживаются структурные и функциональные аномалии. В небольшом проценте случаев у больных не удается выявить ни белка, ни мРНК.

В 15% хромосом у больных с синдромом Леш Нихана ген

HPRT вовлечен в крупные структурные перестройки, корторые могут быть выявлены методами Саузерн или Нозерн блот-гибри- дизации. Синдром Леш Нихана одно из первых моногенных наследственных заболеваний, для которых была проведена моле- кулярная идентификация точечных мутантных аллелей. Именно на этой моделе впервые был разработан и опробован метод анализа мутаций, основанный на расщеплении РНК-ДНК гибридов рибонук- леазой А в местах негомологичноно спаривания (метод расщеп- ления рибонуклеазой А - см.Главу VI, Gibbs, Caskey, 1987).

Комбинация методов блот-гибридизации и расщепления рибонук- леазой А позволяет выявить до 50% мутаций. В настоящее время в гене HPRT найдено более 100 спорадических мутаций, полови- на которых - однонуклеотидные замены типа миссенс, нонсенс и в сайтах сплайсинга. Около 40% мутантных хромосом имеют структурные аномалии, в том числе крупные делеции, нехватки отдельных зкзонов и микроделеции одного или нескольких нук- леотидов. В HPRT-гене, практически, отсутствуют мутации, до- мининирующие по частоте в каких-либо популяциях. Исключение составляет нонсенс мутация R170TER, которая составляет около

15% всех нуклеотидных замен (Gibbs et al., 1989). Также как и при гемофилиях мутации гена HPRT чаще возникают в сперма- тогенезе, чем в оогенезе. Вероятность мутирования возрастает с возрастом отца. Идентифицировано 3 HPRT-псевдогена в хро- мосомах 3, 5 и 11 (Stout, Caskey, 1984).

Описаны редкие случаи синдрома Леш Нихана у гетерози- готных девочек. При этом, как правило, болезнь развивается вследствие неслучайной инактивации X-хромосомы, не содержа- щей мутации (Ogasawara et al., 1989). Однако, у 3-х женщин - облигатных носительниц мутаций в HPRT-гене, селективный тест не выявил присутствия мутантных клеток в культивируемых фиб- робластах и волосяных луковицах. В связи с этим высказано предположение, что определенные мутации гена HPRT находятся в неравновесном сцеплении с неидентифицированной летальной мутацией в X-хромосоме, что и приводит к селекции клона кле- ток только с одной (мутантной или немутантной по гену HPRT)

X-хромосомой (Marcus et al., 1992).

Молекулярная диагностика болезни Леш-Нихана возможна прямыми и непрямыми методами. Прямой вариант основан на про- ведении обратной транскрипции мРНК, ее амплификации,

SSCP-анализе одноцепочечных ДНК фрагментов с их последующим секвенированием (см.Глава VI). Косвенная диагностика пре- дусматривает маркирование мутантной хромосомы при помощи по- лиморфных сайтов (в частности, локуса DXS52 - зонд

St14/TaqI).

Как мы уже отмечали (Главы VII,VIII), первая трансген- ная животная модель наследственного заболевания человека, сконструированная путем направленного переноса мутациий в культивируемые эмбриональные стволовые клетки, была получена для синдрома Леш-Нихана (Hooper et al., 1987; Kuehn et al.,

1987). На этой моделе впервые была проведена генокоррекция наследственного дефекта in vivo. Эти успехи в значительной степени связаны с существованием селективных сред, позволяю- щих вести автоматический отбор мутантных клеток. Вообще, синдром Леш-Нихана представляет собой идеальную систему не только для изучения пуринового метаболизма, но и для решения многих теоретических вопросов биологии и медицины

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49